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12月11日,最新发表于Nature Nanotechnology杂志上的一项研究中,来自美国的一个科学家小组小组带来了纳米技术领域的一项突破成果。研究称,将抗体样RNA纳米粒子嵌附到微囊泡中能够特异性地递送有效的RNA疗法到癌细胞中。

在过去的二十年中,对于大小范围在1纳米到几纳米的材料,研究人员在设计和制造方面进行了广泛的研究,这项全球性的研究工作通常被称为纳米科学或纳米技术,含有纳米材料的成品数量正在快速增长。伍德罗-威尔逊国际学者中心出版了纳米技术消费品详细目录在线数据库,其中列出了1,600多种基于纳米技术的市场消费品。尤其在医疗卫生行业,纳米技术取得重大突破。

图:microRNA在生命活动中参与转录后基因表达调控,来自NIH

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2010年,亚利桑那州艺术史教授伊夫林·索伦森成为一名II期宫颈癌患者,当时癌细胞已经扩散到淋巴结。由于她的生命只有一年时间了,医生告诉她说:告别家人,去度假吧。就像在报纸上的报道中所描述的那样,索伦森不甘心接受这个令人沮丧的预测,坚持要查看临床试验列单,结果她了解到马萨诸塞州剑桥市的一项试验——一家叫做BIND生物科学公司的企业正在利用超小型纳米技术移动颗粒来攻击肿瘤。索伦森参加了一项试验,这项试验是由亚利桑那州凤凰城转译基因组学研究院丹尼尔·凡·霍夫主持的。经过首次治疗,索伦森的肿瘤缩小了70%。几年之后,尽管索伦森仍在服药,但是医生确认她的身体中没有显示出癌症的迹象。

在发现第一个microRNA(miRNA)后的二十多年里,miRNA生物学领域已经大大扩展。基于多个癌症病例的功能学的研究证实,miRNA失调与癌症存在因果关系,miRNA可以作为肿瘤抑制剂或癌基因(oncomiR)。miRNA模拟物和靶向miRNA的分子(antimiR)在临床前发展中显示出极大的前景。

图片来源:Nature Nanotechnology

索伦森利用的临床治疗方法被称为BIND-014,这是一种带有化学涂层的纳米粒子,经过设计,利用这种纳米粒子来寻找恶性细胞,并输送强效化疗药剂——多西他赛。这种粒子允许药物选择性地聚集在患癌部位,使疗效大幅提高。BIND-014疗法是由哈佛医学院的奥米德·法罗哈扎德以及麻省理工学院的研究人员开发的,目前处于各种癌症治疗的II期试验阶段。

几种miRNA靶向治疗已经达到临床开发:

1先前瓶颈

特别是在诊断和治疗癌症方面,纳米医学常常利用各种纳米颗粒。大多数抗癌药物在临床试验中由于整体毒性和缺乏选择性而受到阻碍,因为这些药物不但杀死癌细胞,同时也杀死正常细胞。科学家们正在努力寻找可以选择性地靶向攻击癌细胞和癌组织的抗癌药物,这些药物可以使健康组织丝毫无损。

●肿瘤抑制剂miRNA miR-34的模拟物其达到用于治疗癌症的临床I期试验

使用siRNA(small interfering RNA)和RNA干扰技术的疗法正在改变癌症治疗,但由于一直没有办法将这类药物直接输送到人体内的癌细胞中,因此,评估这些药物的临床试验一个接一个地失败了。此外,即使这些药物能到达并进入癌细胞,但它们容易被困在称为核内体的细胞内部囊泡中,导致疗效降低,甚至失效。

通过提高靶向药物的输送效率,纳米医学提供了改进抗癌药物输送的替代方法。抗癌化合物依附于量子点和碳纳米管之类的纳米粒子上,被携带着高效地穿过细胞和组织,等待着被细胞吸收。在10至100纳米的尺度范围内,当纳米颗粒属于相对较大的尺度时,它们不能穿过紧密挤在一起的细胞内层而进入相邻的组织。然而,当药物分子依附于颗粒上时,它们在血液中保持着稳定性,同时也保持着完整性,直到目标明确地达到肿瘤。这些纳米颗粒药物轭合物之所以能够明确地指向癌细胞,这是由其大小、形状和表面特征而决定的。最终,纳米颗粒药物的选择性使药物对癌细胞的作用达到最大化,使健康细胞完好无损,对患者产生的副作用较少。

●针对miR-122的antimiRs,其达到用于治疗肝炎的II期试验

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BIND-014是救助了伊夫林·索伦森的药物,是靶向药物输送方面最有前途的纳米粒子之一。BIND-014已经通过了I期临床试验的安全性测试,现在正在接受II期试验,以测试其在治疗肺癌和前列腺癌方面的疗效。BIND-014是通过聚合物线组装起来的,这种聚合物线能够自发折叠形成颗粒。聚合物散布在靶向分子或靶向离子上,这些分子和离子跟另一种分子结合,并通过设计将它们关联到通往癌细胞的粒子上。这种自组装过程使得批量繁殖分子更加容易,并且最终有可能表现出独特的优势,将这一技术转化到临床应用上来。

关于miRNA

2攻克难题

另一种有希望的抗癌药物是CALAA-01,它是输送颗粒RONDEL和小干扰RNA分子的组合,通过影响癌细胞RNA的功能来抑制肿瘤生长。CALAA-01中的siRNA受到保护,在稳定的纳米颗粒内不会降解。目前,该药已进入Ib期临床试验阶段。

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在这项新研究中,论文的通讯作者、俄亥俄州立大学首席讲座教授、深圳宣泽生物全球首席科学顾问郭培宣教授团队解决了两个主要的问题:1)将治疗剂通过囊泡靶向递送至肿瘤细胞中;2)在包含治疗剂的囊泡进入癌细胞后,使其能够躲过核内体的“捕获”。

胡德良译自美国科学家网站(americanscientist.org)

图:miRNA的形成,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

具体来说,研究中,郭教授和他的同事们设计出了一种携带抗体样RNA分子的胞外囊泡(extracellular microvesicles)。这类抗体样RNA分子被称为适配体(aptamer),可与癌细胞过表达的表面标志物相结合

miRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的核糖核酸(RNA)分子,可调节其他基因的表达,但无法进一步转译成蛋白质的RNA,属于非编码RNA。miRNA通过与目标信使核糖核酸(mRNA)结合,进而抑制转录后的基因表达,在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。miRNA从初级转录本(primarytranscript),也就是pri-miRNA,转变成为称为pre-miRNA的茎环结构,最后成为具有功能的miRNA。第一个miRNA是1989年Victor在秀丽隐杆线虫 ( C. elegans) 发现 lin-4miRNA。miRNA分子的一端折回来形成不完全的互补配对,形成典型的"发卡结构"。

1)为了抑制前列腺癌,囊泡被设计成与前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)特异性结合;

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2)为了抑制乳腺癌,囊泡被设计为与表皮生长因子受体 特异性结合;

图:miRNA的“发卡”结构,来自wiki

3)为了抑制人类来源的结肠直肠癌移植,囊泡被设计成特异性结合叶酸受体

miRNA和癌症微环境

此外,所有的囊泡都载有用于下调survivin基因的siRNA。该基因抑制了细胞凋亡,并在多种癌症类型中过表达。

肿瘤微环境中的细胞,如内皮细胞,成纤维细胞和免疫细胞,通过分泌调节肿瘤微环境生理(包括缺氧,pH和炎症)的因子与癌细胞相互作用。miRNA通过靶向参与这些相互作用的几个基因来调节这些相互作用,作为促进肿瘤的信号。

3关键结果

miRNA和癌症相关的成纤维细胞(CAF)

最终,科学家们得到了以下3点关键发现:

CAF为癌细胞在初始恶性肿瘤和转移过程中粘附和生长提供了基质框架。已知在将正常成纤维细胞转化为CAF中起作用的重要miRNA之一是miR-320。正常成纤维细胞中miR-320的下调导致mRNA靶标ETS2(癌症特异性转录因子)的增加,导致包含致癌性分泌蛋白的蛋白酶例如基质金属蛋白酶(MMP)的增加。虽然没有测试,成纤维细胞中miR-320的替代可以具有有意义的抗转移作用。

第一,靶向PSMA的囊泡在动物模型中完全抑制了前列腺癌生长,并没有被观察到毒性作用;

miRNA和炎症

第二,靶向EGFR的囊泡在动物模型中有效抑制了乳腺癌生长;

肿瘤微环境中的炎症通常通过改变成纤维细胞表型而促肿瘤发生和血管生成和癌细胞的侵入。miRNA可以显著增加炎症相关蛋白如NF-κB的表达,导致微环境中的肿瘤前期变化。 LIN28-let-7介导的细胞因子白介素-6级联的去抑制,导致癌细胞中NF-κB的活化,这导致炎症信号的进一步增加。通过let-7模拟物的递送在肿瘤微环境中破坏这种正反馈环可导致剧烈的效应。let-7在癌细胞中的表达减少增殖并增强凋亡,并且当在肿瘤微环境中的细胞中表达时,可以减少炎症,导致对于肿瘤生长较不利。miR-155是关键的致癌miRNA,靶向SHIP1,一种参与免疫应答调节的蛋白质81。临床前模型中,用pH诱导的跨膜定位肽缀合的antimiR-155治疗导致显着的肿瘤减少。总之,在靶向已知在癌细胞中具有促肿瘤功能的miRNA之前,需要首先仔细评估它们在肿瘤微环境的细胞中的作用。以综合方式测试这样的miRNA的作用将提供关于miRNA的背景依赖性功能的信息,并且将有助于鉴定用于癌症治疗的合适靶标。

第三,靶向叶酸受体的囊泡在动物模型中显着抑制了移植自结肠癌患者的肿瘤生长。

miRNA治疗的化学修饰

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1. 基于miRNA的治疗剂

4未来前景

●miRNA模拟物

对于这项成果,郭培宣教授表示:“总体而言,我们的研究表明RNA纳米技术可以用于设计天然的胞外囊泡,使之特异性地将siRNA递送至癌细胞中。”

miRNA模拟物是与相应的miRNA序列匹配的合成双链小RNA分子,因此功能上旨在补充疾病中丢失的miRNA表达。

目前,研究者们正在努力将这一技术转化为临床使用。此外,科学家们认为,该研究有望促进siRNA、microRNA和其他RNA干扰技术用于新一代抗癌药物的开发。

●miRNA(也称为antimiR)抑制剂

antimiR是单链的基于第一代反义寡核苷酸(ASO),其已被设计为靶向mRNA或用锁定核酸(LNA)修饰。具有2'-O-甲氧基乙基修饰的AntimiR也称为拮抗剂。这些合成的小RNA分子具有与待抑制的miRNA互补的序列,并通过与其强烈结合而阻断相应miRNA的功能。

多年来,通过对核苷酸主链的化学修饰,已经实现了miRNA模拟物和antimiR的结合亲和力、稳定性和靶调节作用的显著改进。

2. miRNA化学修饰的挑战和策略

基于RNA的治疗策略(包括单链或双链寡核苷酸)的挑战之一是通过血清中或细胞内吞细胞区室中的核糖核酸酶降解寡核苷酸的可能性

为了避免细胞内的降解的问题,已经研究了两种不同的策略:

●改变寡核苷酸化学性质,可以通过甲基化或LNAs,来修饰核苷酸或RNA骨架,或通过添加硫代磷酸酯类基团

●开发用于包封RNA以用于保护和允许内体逃逸的递送载体。目前可用的商业miRNA模拟物通常通过过客链(passengerstrand)的甲基化修饰以增加稳定性,并且使用LNA化学修饰抗miR。然而,开发化学修饰的miRNA治疗剂的大部分努力致力于antimiR的开发。

癌症等疾病治疗的临床前模型中miRNA靶标

包括知名的let-7家族,miR-34a, miR-143等,对应多种实体瘤癌症、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淋巴性白血病、丙型肝炎等疾病和癌症的治疗。

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表:癌症等疾病治疗的临床前模型中miRNA靶标,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

miRNA治疗的导入系统

●病毒载体

●聚丙交酯共乙交酯颗粒(Poly(lactide-co-glycolide) particles)

●中性脂质乳剂 (Neutral lipid emulsions)

●中性脂质体1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(Neutral liposome 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)

●EnGeneIC 载体纳米细胞(EnGeneIC Delivery Vehicle nanocells)

●合成聚乙烯亚胺

●树枝状聚合物

●环糊精

●聚乙二醇

●壳聚糖

●N-乙酰基-D-半乳糖胺

miRNA治疗的关键步骤

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图:miRNA治疗的关键步骤,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

miRNA治疗包括:

●通过分析患者样品,选择的miRNA候选物

●使用组织培养阐明miRNA候选物对疾病的生物学和相关性

●基于体内模型的验证。目前,有几个公共数据库(比如mirbase,miR2Disease,miRCancer,mirtarbase等),包含来自各种健康和疾病组织的基因组和蛋白质组数据。将这些数据与生物验证结合可以有助于鉴定有希望的候选miRNA。

●体内应用的miRNA模拟物和antimiR的化学修饰和递送系统的开发。通过化学修饰,例如添加2'-O-甲基或锁定核酸(LNA)。除了对小RNA分子的化学修饰之外,已经开发了几种包封方法,改进向疾病部位的递送。一些常用的递送系统是脂质纳米粒子,例如中性脂质乳液(NLE)或具有连接的靶向部分的树枝状聚合物复合物。将这些递送系统翻译成临床的关键挑战是潜在的免疫刺激效应和缺乏特异性靶向疾病部位。

●使用啮齿动物和非人灵长类动物模型的严格的疾病特异性体内测试。需要仔细评估毒性数据和目标评估,以避免临床试验中的早期失败。

miRNA治疗的临床试验

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图:miRNA治疗的临床试验,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

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