递送miRNA的新载体治疗骨质疏松 图片 1

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科研人员正在开发microRNAs增强组织再生的功能。1月14日的Naturecommunication报导了一个具有高亲和力和没有细胞毒性作用的miRNA的超支化聚合物,这个聚合物可以组装成双壳的纳米级复合物的高效率转染体系。

图:microRNA在生命活动中参与转录后基因表达调控,来自NIH

2019年11月4日,欧洲分子生物学实验室Orsolya Barabas及德国维尔茨堡大学Michael Hudecek共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为"A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion"的研究论文,该研究设计创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶。该研究证明,hsSB可以与转座子DNA一起传递,以遗传修饰细胞系和胚胎,造血和诱导多能干细胞,克服了不受控制的转座酶活性。

由于库仑斥力,miRNA及其模拟物和抑制剂,都是带负电荷的,不能很容易地穿过细胞膜。此外,“裸”miRNA在体内迅速退化。因此,保护和提供miRNA进入细胞的载体是miRNA的治疗需要。尽管病毒载体能有效进入细胞中,这些病毒载体的免疫反应是很严重。脂质体转染效率又太低。聚合物载体比病毒载体的免疫原性较差,价格便宜。因此,目前用于DNA和短干扰RNA的载体。然而高的分子量的聚合物载体对细胞是有毒的,低分子量的转染效率却太低。

在发现第一个microRNA(miRNA)后的二十多年里,miRNA生物学领域已经大大扩展。基于多个癌症病例的功能学的研究证实,miRNA失调与癌症存在因果关系,miRNA可以作为肿瘤抑制剂或癌基因(oncomiR)。miRNA模拟物和靶向miRNA的分子(antimiR)在临床前发展中显示出极大的前景。

研究人员使用hsSB生成嵌合抗原受体T细胞,在体外和异种移植小鼠中均显示出强大的抗肿瘤活性。有趣的是,该研究发现hsSB可自发穿透细胞,从而无需使用转染试剂即可修饰iPSC和生成CAR T细胞。hsSB每个基因组仅进行两次整合。总之,该技术由于其简单性和多功能性,与目前的标准相比,将大大降低制造成本,并有助于增加基因和细胞疗法的应用。

持续递送miRNA可激活内源性干细胞和祖细胞,对组织缺损进行再生。该研究设计了一种超支化聚合物miRNA载体,这种聚合物载体封装在可生物降解微球中。微球在不依赖细胞的纤维聚合物支架的空间控制下释放miR-26a。克服了不受控制的释放,释放时间可调节;解决了当前的miRNA递送系统相关的问题,转染效率高。

几种miRNA靶向治疗已经达到临床开发:

细胞和生物体中引入所需的转基因已成为研究和生物技术的关键技术,离体工程改造的人类细胞的临床应用证明了其在再生医学和癌症治疗中的治疗潜力。例如,最近将重组基因的T细胞与含有CAR的遗传信息一起使用已成为癌症治疗的新支柱,在白血病和淋巴瘤治疗中表现出显著的应答率。在这些疗法中,CARs作为合成免疫受体,可为T细胞提供针对恶性肿瘤相关抗原的新特异性,从而指导免疫系统攻击和根除肿瘤细胞。

具体方法是超支化聚合物HP和miRNA在水中形成多聚物,形成的多聚物通过双重乳化作用封装在PLGA微球,然后含HP/miRNA形成的PLGA微球附着在PLLANF支架。把PLGA微球的PLLA支架植入小鼠。PLGA微球体可以通过内吞作用进入细胞,经过酶降解聚合物,使调控基因表达的miRNA在胞内释放。

●肿瘤抑制剂miRNA miR-34的模拟物其达到用于治疗癌症的临床I期试验

高溶解度SB蛋白变异体的设计和表征

该研究通过以GSK-3β为靶标,激活内源性干细胞的成骨活性,使骨质疏松小鼠骨再生,从而解决在实现基于不依赖于细胞的组织工程支架的miRNA治疗,即在再生医学上的一个重要的挑战。

●针对miR-122的antimiRs,其达到用于治疗肝炎的II期试验

为了引入CAR基因,当前的方案依赖于病毒载体,该病毒载体提供有效的基因转移,但是需要漫长而昂贵的生产才能用于临床。病毒载体编码的抗原决定簇也具有促炎反应的风险,转录区域的优先整合可能会导致不利的基因组变化。非病毒载体的使用可以提高安全性并降低成本,但是受到基因转移效率,有限的转基因大小和载体DNA或RNA的细胞毒性的限制。例如,非病毒基因组编辑核酸酶可以简单,低成本地进行特定位点的基因组修饰,但它们依赖于DNA插入的同源性定向修复,通常在原代细胞中很少发生。

全世界大约有2亿人患有骨质疏松症,他们骨愈合的能力大打折扣。在这项工作中,长期高效miR-26a递送,显示成骨细胞的骨再生,可以修复骨质疏松患者受损的骨再生能力。该技术也可以递送其他治疗性核酸(DNA、mRNA的siRNA,miRNA等)或它们的抑制剂来再生组织或治疗其他疾病。

关于miRNA

通过直接hsSB递送进行高效的细胞工程

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DNA转座子是基因传递的另一种非病毒替代物。它们包含两个基本成分:转座酶和转座子DNA,常规地,两种组分均作为质粒DNA载体提供,并且转座酶在靶细胞中表达。表达后,转座酶蛋白特异性结合货运载体的转座子末端,切除转基因并将其整合到靶细胞的基因组中。随着转座子能够插入DNA,它们引起的转基因效率与慢病毒载体相似。同时,它们在免疫原性,插入特性,货物容量,临床实施的复杂性和成本方面具有良好的属性。

图:miRNA的形成,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

广泛使用的转座子系统是SB,它是从鱼类基因组中的非活性拷贝重建的合成元件。由于其在脊椎动物中的高插入效率,SB已被用于功能基因组学,癌症基因发现,转基因和基因治疗应用。在医学领域,SB已用于临床1或2期临床试验中,用于治疗性细胞的体外工程改造,包括生产用于癌症免疫疗法的CAR T细胞。

miRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的核糖核酸(RNA)分子,可调节其他基因的表达,但无法进一步转译成蛋白质的RNA,属于非编码RNA。miRNA通过与目标信使核糖核酸(mRNA)结合,进而抑制转录后的基因表达,在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。miRNA从初级转录本(primarytranscript),也就是pri-miRNA,转变成为称为pre-miRNA的茎环结构,最后成为具有功能的miRNA。第一个miRNA是1989年Victor在秀丽隐杆线虫 ( C. elegans) 发现 lin-4miRNA。miRNA分子的一端折回来形成不完全的互补配对,形成典型的"发卡结构"。

然而,包括SB在内的当前转座子系统的一个重要缺点是靶细胞中发生的转座事件没有得到很好的控制。特别是,使用转座酶编码的DNA会引起蛋白质表达的延长。对转座酶暴露的时间和动力学缺乏控制会带来进行性和不受控制的转座,细胞毒性。对于SB,蛋白质聚集,低稳定性和低溶解度仍然是蛋白质生产和递送的主要瓶颈。

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hsSB转座酶具有固有的细胞穿透特性

图:miRNA的“发卡”结构,来自wiki

在该研究中,基于过度活跃的SB100X变体的晶体结构,使用了合理的蛋白质设计来创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶。该研究证明,hsSB可以与转座子DNA一起传递,以遗传修饰细胞系和胚胎,造血和诱导多能干细胞,克服了不受控制的转座酶活性。研究人员使用hsSB生成嵌合抗原受体T细胞,在体外和异种移植小鼠中均显示出强大的抗肿瘤活性。有趣的是,该研究发现hsSB可自发穿透细胞,从而无需使用转染试剂即可修饰iPSC和生成CAR T细胞。hsSB每个基因组仅进行两次整合。

miRNA和癌症微环境

总之,该技术由于其简单性和多功能性,与目前的标准相比,将大大降低制造成本,并有助于增加基因和细胞疗法的可及性。

肿瘤微环境中的细胞,如内皮细胞,成纤维细胞和免疫细胞,通过分泌调节肿瘤微环境生理(包括缺氧,pH和炎症)的因子与癌细胞相互作用。miRNA通过靶向参与这些相互作用的几个基因来调节这些相互作用,作为促进肿瘤的信号。

关于Sleeping Beauty转座子系统

miRNA和癌症相关的成纤维细胞(CAF)

在乎识第二个microPAJERONA(miEnclaveNA)后的八十多年里,研讨人士动用hsSB生成嵌合抗原受体T细胞。Sleeping Beauty转座子系统是哺乳动物细胞中一种有效的非病毒基因转移工具,但其广泛使用受到DNA载体转座酶基因活性不受控制,基因组不稳定的风险以及无法直接使用该转座酶蛋白的限制。

CAF为癌细胞在初始恶性肿瘤和转移过程中粘附和生长提供了基质框架。已知在将正常成纤维细胞转化为CAF中起作用的重要miRNA之一是miR-320。正常成纤维细胞中miR-320的下调导致mRNA靶标ETS2(癌症特异性转录因子)的增加,导致包含致癌性分泌蛋白的蛋白酶例如基质金属蛋白酶(MMP)的增加。虽然没有测试,成纤维细胞中miR-320的替代可以具有有意义的抗转移作用。

miRNA和炎症

肿瘤微环境中的炎症通常通过改变成纤维细胞表型而促肿瘤发生和血管生成和癌细胞的侵入。miRNA可以显著增加炎症相关蛋白如NF-κB的表达,导致微环境中的肿瘤前期变化。 LIN28-let-7介导的细胞因子白介素-6级联的去抑制,导致癌细胞中NF-κB的活化,这导致炎症信号的进一步增加。通过let-7模拟物的递送在肿瘤微环境中破坏这种正反馈环可导致剧烈的效应。let-7在癌细胞中的表达减少增殖并增强凋亡,并且当在肿瘤微环境中的细胞中表达时,可以减少炎症,导致对于肿瘤生长较不利。miR-155是关键的致癌miRNA,靶向SHIP1,一种参与免疫应答调节的蛋白质81。临床前模型中,用pH诱导的跨膜定位肽缀合的antimiR-155治疗导致显着的肿瘤减少。总之,在靶向已知在癌细胞中具有促肿瘤功能的miRNA之前,需要首先仔细评估它们在肿瘤微环境的细胞中的作用。以综合方式测试这样的miRNA的作用将提供关于miRNA的背景依赖性功能的信息,并且将有助于鉴定用于癌症治疗的合适靶标。

miRNA治疗的化学修饰

1. 基于miRNA的治疗剂

●miRNA模拟物

miRNA模拟物是与相应的miRNA序列匹配的合成双链小RNA分子,因此功能上旨在补充疾病中丢失的miRNA表达。

●miRNA(也称为antimiR)抑制剂

antimiR是单链的基于第一代反义寡核苷酸(ASO),其已被设计为靶向mRNA或用锁定核酸(LNA)修饰。具有2'-O-甲氧基乙基修饰的AntimiR也称为拮抗剂。这些合成的小RNA分子具有与待抑制的miRNA互补的序列,并通过与其强烈结合而阻断相应miRNA的功能。

多年来,通过对核苷酸主链的化学修饰,已经实现了miRNA模拟物和antimiR的结合亲和力、稳定性和靶调节作用的显著改进。

2. miRNA化学修饰的挑战和策略

基于RNA的治疗策略(包括单链或双链寡核苷酸)的挑战之一是通过血清中或细胞内吞细胞区室中的核糖核酸酶降解寡核苷酸的可能性

为了避免细胞内的降解的问题,已经研究了两种不同的策略:

●改变寡核苷酸化学性质,可以通过甲基化或LNAs,来修饰核苷酸或RNA骨架,或通过添加硫代磷酸酯类基团

●开发用于包封RNA以用于保护和允许内体逃逸的递送载体。目前可用的商业miRNA模拟物通常通过过客链(passengerstrand)的甲基化修饰以增加稳定性,并且使用LNA化学修饰抗miR。然而,开发化学修饰的miRNA治疗剂的大部分努力致力于antimiR的开发。

癌症等疾病治疗的临床前模型中miRNA靶标

包括知名的let-7家族,miR-34a, miR-143等,对应多种实体瘤癌症、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淋巴性白血病、丙型肝炎等疾病和癌症的治疗。

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表:癌症等疾病治疗的临床前模型中miRNA靶标,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

miRNA治疗的导入系统

●病毒载体

●聚丙交酯共乙交酯颗粒(Poly(lactide-co-glycolide) particles)

●中性脂质乳剂 (Neutral lipid emulsions)

●中性脂质体1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(Neutral liposome 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)

●EnGeneIC 载体纳米细胞(EnGeneIC Delivery Vehicle nanocells)

●合成聚乙烯亚胺

●树枝状聚合物

●环糊精

●聚乙二醇

●壳聚糖

●N-乙酰基-D-半乳糖胺

miRNA治疗的关键步骤

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图:miRNA治疗的关键步骤,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

miRNA治疗包括:

●通过分析患者样品,选择的miRNA候选物

●使用组织培养阐明miRNA候选物对疾病的生物学和相关性

●基于体内模型的验证。目前,有几个公共数据库(比如mirbase,miR2Disease,miRCancer,mirtarbase等),包含来自各种健康和疾病组织的基因组和蛋白质组数据。将这些数据与生物验证结合可以有助于鉴定有希望的候选miRNA。

●体内应用的miRNA模拟物和antimiR的化学修饰和递送系统的开发。通过化学修饰,例如添加2'-O-甲基或锁定核酸(LNA)。除了对小RNA分子的化学修饰之外,已经开发了几种包封方法,改进向疾病部位的递送。一些常用的递送系统是脂质纳米粒子,例如中性脂质乳液(NLE)或具有连接的靶向部分的树枝状聚合物复合物。将这些递送系统翻译成临床的关键挑战是潜在的免疫刺激效应和缺乏特异性靶向疾病部位。

●使用啮齿动物和非人灵长类动物模型的严格的疾病特异性体内测试。需要仔细评估毒性数据和目标评估,以避免临床试验中的早期失败。

miRNA治疗的临床试验

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图:miRNA治疗的临床试验,来自doi:10.1038/nrd.2016.246

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