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在动物或人类中进行测试之前,大多数癌症药物在实验室培养皿中生长的肿瘤细胞中进行评估。然而,近年来,人们越来越认识到这些细胞生长的环境不能准确地模拟肿瘤的自然环境,并且这种差异可能产生不准确的结果。

撰文丨Anne Trafton

癌症研究的投入与产出一直难成正比,重复性也一直饱受诟病。为了实验更加简便安全,人类将癌细胞放在培养皿里进行研究,但超过 60 年,体外培养癌细胞的培养基一直没有更换过。许多科学家已经表示这种常规培养基与体液相差甚远,可能改变了癌细胞的性质,这也是癌症研究无法重复的原因,因为实验从一开始就错了。

在一项新研究中,麻省理工学院的生物学家分析了通常围绕胰腺肿瘤的组织间液的组成,发现其营养成分与通常用于培养癌细胞的培养基不同。它也不同于血液,血液可以输送间质液并去除废物。

翻译丨董依明

改变基础研究的液体

研究结果表明,与这种液体更相似的培养基中生长的癌细胞可以帮助研究人员更好地预测实验药物如何影响癌细胞,麻省理工学院生物学副教授,科赫综合研究所成员Matthew Vander Heiden说。癌症研究。

审校丨杨心舟

1959 年,一名叫 Harry Eagle 的医生制造了一瓶改变整个当代生物医药学研究的试剂,这瓶试剂看起来红得通透,隔远看就像人的血液一样,除了外观,里面的添加成分也在模拟人体的体液,包含了葡萄糖、盐分、必须的维生素以及氨基酸分子。就像神奇魔法一样,这种液体可以用来在体外培养细胞,许多人类和动物的细胞只要放在这种红色液体中就能迅速生长,因此也是生物医学研究者拿来做细胞实验的标杆液体。

这是一个明显的声明,肿瘤环境很重要,但我认为在癌症研究中,钟摆已经向基因转移,人们往往会忘记这一点,该研究的高级作者之一范德海登说。

通常,对抗癌药物的研究都会先在实验器皿中进行,然后才在动物或人身上进行测试。但近些年大家逐渐意识到,实验室内癌细胞的生长环境与自然状态下肿瘤细胞的生长环境并不吻合,这种差异可能会导致实验结果产生误差。

这种液体在专业领域被称作EMEM(Eagles minimal essential medium),现在已经算得上是祖父辈的产品了,字面意思就是让细胞存活的最精简成分,不负责其他的特殊支持。在它诞生后的 60 年里,研究者还在不断对其进行更新。无论是研究病毒攻击,还是病理特征,只需要改变里面的一些小成分,EMEM 马上就可以在实验室实现更新换代。如今,在实验室最受欢迎的应该是 EMEM 的二代产品DMEM,这是 1975 年诺奖得主 Renato Dulbecco 的改进版本,取名也是非常随意,就在 Eagle 名字前加上了自己的名字叫 Dulbeccos Modified Eagles Medium,这也成了做细胞实验培养液的经典代号,DMEM。

Alex Muir,前科赫研究所博士后现任芝加哥大学助理教授,也是该论文的高级作者,该论文刊登在4月16日的eLife期刊上。该研究的主要作者是麻省理工学院研究生Mark Sullivan。

组织液是存在于细胞周围间隙的液体环境。在一项新的研究中,麻省理工的生物学家分析了胰腺癌细胞的组织液,发现其与实验室培养基的成分并不相同,而且也不同于用于营养供给与废物排出的血液成分。

当然这两种液体只能说可以维持细胞的基本生理状态,也就是说这两种液体培养基与实际体内的血液环境相差还是非常大的。如果想要更准确地研究细胞的生化性质,还要根据需求进行额外分子的补充。这一点在癌细胞研究中非常重要,因为癌细胞的特性与正常细胞相差很大,用 EMEM 或 DMEM 来培养可能会造成极大的数据错误。任职于英国比森癌症研究所的 Saverio Tardito 就表示,现在 90% 癌症相关研究都在采用两种基础培养基,这些实验可能一开始就错了,直接对结果产生了影响。但是现在已经有能养活细胞的培养基摆在那,谁又会舍近求远去自己再造一瓶新的呢?

环境很重要

“培养基的成分与组织液越相似,我们就能更准确地对抗癌药物进行研究。”Matthew Vander Heiden说道,他是麻省理工学院生物学副教授,也是 Koch 综合癌症研究所的成员。

癌症研究的窘境

科学家早就知道,癌细胞代谢营养素的方式与大多数其他细胞不同。这种替代策略有助于他们产生他们继续生长和分裂所需的构建模块,形成新的癌细胞。近年来,科学家们开始寻求开发干扰这些代谢过程的药物,并且在2017年批准了一种此类药物用于治疗白血病。

“很明显,培养癌细胞的微环境很重要,但我认为现在已经转向基因分析技术来开展癌症研究,人们通常会忽略“培养环境”的问题。”Vander Heiden说,他是该研究的主要作者之一。

近些年来,许多基础研究学科都遭受了重复性危机,除开多年饱受诟病的心理学研究,癌症研究也逐渐走入了歧途。在美国,政府每年要在癌症研究上投入将近 50 亿美金,这还不包括私人企业和其他机构参与支持的研究。但是投入和产出并没有成正比,过去 20 年癌症死亡率并没有预期的下降快,许多相关研究最终都走进了死胡同。

开发此类药物的一个重要步骤是在实验室培养皿中培养的癌细胞中测试它们。通常用于生长这些细胞的生长培养基包括碳源(例如葡萄糖),氮和其他营养素。然而,在过去几年中,Vander Heiden的实验室发现,在这种培养基中生长的癌细胞对药物的反应不同于在小鼠癌症模型中的反应。

环境很重要

美国在 2016 年 2 月开启了耗资 10 亿美金的癌症登月计划,为的就是让癌症研究更科技、更高效。时间过去将近 3 年,癌症研究却进展迟缓,Slate 杂志的评论稿就曾指出这种发展迟缓是不可能靠金钱投入来解决的。因为大多数的癌症研究结果是不可信的,实验数据混乱,实验结果不稳定,实验方法不工作。

怀特黑德研究所的成员兼麻省理工学院生物学教授大卫萨巴蒂尼也发现,如果药物生长在类似于人体血浆营养成分的培养基中,而不是传统的生长培养基,那么药物会对癌细胞产生不同的影响。

癌细胞代谢的方式与大多数细胞不同,这种特殊的营养获取策略可以让癌细胞获得生长所需的原料,不断分裂形成更多的癌细胞。近年来,科学家们一直致力于开发干扰癌细胞代谢的药物,并在2017年批准了一种用于治疗白血病的药物。

全球生物标准研究所的首席主任 Leonard P。 Freedman,2015 年发表了一篇题为基础实验不可重复中的经济学的文章,里面指出超过半数的基础研究结果不可信,其他实验室根本重复不出来。癌症研究中常用的癌细胞培养可能就会出现错误,如癌细胞类型错误或者不同癌细胞交叉污染,预计占到癌症研究的 15%-36%,但是当时并没有给出造成这种现象的原因。

这项工作,以及世界各地其他几个团体的类似结果表明环境很重要,范德海登说。对我们来说真的是一个警醒,要真正了解如何找到癌症的依赖性,我们必须让环境正确。

在培养皿中测试药物对癌细胞生长的干扰能力至关重要。通常,培养基需要碳源,氮源,还有一些其他的营养素。然而过去几年,Vander Heiden的实验室发现,药物在培养基与小鼠模型中对癌细胞的作用效果并不相同。

在 2012 年,美国安进癌症研究中心前任主席 Glenn Begley 就曾领导开展过大批量的往期实验重复,并将结果发表在了Nature上。就结果显示,53 项在癌症领域被称作里程碑式的研究,只有 6 项可以重复出来。大多数情况下,癌症研究在发表前都是处于严格保密状态,所有的实验条件都限制在唯一的实验室中,这就形成了只能通过实验室自查来保证实验结果,但许多研究室为了课题多向发展人手往往并不充足,连自查的都可能寥寥无几。

为此,麻省理工学院的研究小组决定研究组织间液的组成,组织间液可以吸收从血液中流过毛细血管扩散的营养物质。它的成分与血液的成分不同,在肿瘤中,它可能非常不同,因为肿瘤通常与血液供应的联系很差。

Whitehead 研究所的成员兼麻省理工学院生物学教授David Sabatini也发现,对比药物对两种培养基中癌细胞的影响:类似人体血浆成分的培养基与传统培养基,产生的结果也不同。

这种反馈机制的深层原因在于生物学家的坏习惯,在一切癌症研究中都是效率和金钱至上,至于实验结果的准确性则需要排到第三,为了获得相同的实验结果意味着需要额外增派一个人手以及投入更多的资金来进行重复,这对于任何实验室来说都是效率低下的。因此想要验证癌症研究中到底哪里出了问题就更难了,而所有癌症研究中都为了图方便采用的基础培养基 DMEM 一直备受科学家的关注。坏习惯在这体现得淋漓尽致,正如 Saverio Tardito 上面所说,没人想再花时间自己去配一瓶新的培养基,认为用一瓶可以养活癌细胞的培养基就足够了。

研究人员选择将注意力集中在胰腺癌上,部分原因是因为人们知道它特别缺乏营养素。在从小鼠胰腺肿瘤中分离间质液后,研究人员使用质谱法测量了100多种不同营养素的浓度,发现组织间液的组成与血液的组成不同(并且通常与培养基的组成不同)用来生长细胞)。研究人员发现,肿瘤间质液耗尽的一些营养素是对免疫细胞功能很重要的氨基酸,包括精氨酸,色氨酸和胱氨酸。

“世界各地的类似结果都表明,癌细胞的生长环境对实验结果的确很重要,” Vander Heiden说。“这倒给我们提了个醒,要真正了解癌症细胞依赖怎样的条件生存,我们必须将其培养在准确的环境中。”

培养基造成了不可重复?

并非所有的营养素都在间质液中耗尽 - 有些更丰富,包括氨基酸甘氨酸和谷氨酸,已知这些氨基酸由一些癌细胞产生。

为此,研究团队最终决定对组织液的成分展开研究,组织液可以吸收毛细血管扩散到血液中的营养物质,其组成成分并不是与血液完全一样。而在肿瘤细胞之间的组织液成分差异就更大,因为肿瘤中的血液供给不如正常组织。

在今年 1 月 2 日发表在 Science Advance 上的一篇文章,Tardito 展示了应该如何改进培养癌症细胞的培养基,他通过数年的配制和比较选择,选出了一种真正适合癌细胞生长的培养基,它称其为Plasmax,该培养基里面含有血液中常见的 60 种营养和化学分子。我们并没有把制造培养基当做一个课题来做, Tardito 表示,但是从改变使用培养基的一开始,我们就发现细胞状态不一样了。

位置,位置,位置

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目前实验室普遍采用 DMEM 培养癌细胞系,但是并没有完全地模拟体内的环境,DMEM 里面有一种被称作丙酮酸盐的成分是正常血液中的 10 倍。把癌细胞放在 DMEM 中培养意味着让癌细胞强行适应了一种新环境,即使实际氧气充足,但对癌细胞来说其就类似生存在缺氧条件下。

研究人员还比较了胰腺和肺部生长的肿瘤,发现间质液的成分可能因肿瘤在体内和肿瘤起源部位的位置而异。他们还发现,在相同位置生长但具有不同基因组成的肿瘤周围的液体之间存在轻微差异;然而,测试的遗传因素没有肿瘤位置那么大的影响。

于是,特别缺乏营养素的胰腺癌成了实验的对象。研究人员将组织液从小鼠胰腺肿瘤中分离,使用质谱法测量了其中100多种营养素的浓度,发现组织液的组成与血液的组成不同(并且通常与培养基的组成也不同)。研究结果显示,肿瘤组织液耗尽的一些营养素是对免疫细胞功能很重要的氨基酸,包括精氨酸,色氨酸和胱氨酸。

最显著的是,不同于 DMEM,新配制的 Plasmax 里面添加了硒,体内一种重要的矿物元素。Tardito 在培养乳腺癌细胞时比较了这两种培养基,在癌细胞低密度状态下,DMEM 不含有硒,癌细胞全部死亡,但是在含有硒的 Plasmax 中能顺利发展壮大。这种结果非常出乎意料,许多保健品都宣称补充硒元素能够抗癌,尽管没有任何研究直接支持这种说法。但 Plasmax 中的实验结果似乎说明,硒元素在密度极低的癌细胞生长过程中起着重要作用。如果是这样的话,人体内过量的硒元素可能是造成肿瘤转移的可能成因,因为肿瘤迁移后细胞数目都不会太多,硒元素可能助力了这一过程。我们还需要更多的实验来验证这一现象。 Tardito 表示。

这可能说明了什么决定环境中的营养成分是由癌细胞和肿瘤内非癌细胞之间的相互作用决定的,范德海登说。

但并非所有营养素都在组织间液中耗尽,里面有一些营养素甚至更为丰富,包括一些由癌细胞产生的氨基酸,如甘氨酸和谷氨酸。

Tardito 也并不是第一个发现培养基对癌细胞生长有影响的人,2017 年美国麻省理工白头研究所的 David Sabatini 就自己配制了类似血液成分的培养基,他发现在自制培养基中生长的肿瘤细胞与在 DMEM 中的相比,对化疗药物敏感度明显下降。Tardito 认为癌症研究不能重复的很大原因,正是由于实验所用的培养基,其没有完全模拟体内的环境,可能直接导致不同实验室之间使用的癌细胞已经不太一样了。

科学家此前发现,癌细胞可以募集那些非癌细胞,包括支持性基质细胞和免疫细胞,以帮助重建肿瘤周围的环境,促进癌症的存活和传播。

癌细胞的位置很重要

值得一提的是,几十年前就开始流水生产的人类癌细胞系许多都培养在 DMEM 中,然后进行收获再出售给全球各地的实验室。也就是说随着实验用癌细胞一代又一代的传播,这些癌细胞可能已经变得适应起 DMEM 的环境,展现出的理化性质已经和人体内完全不一样,现在的癌症相关实验对象更像是 DMEM 癌细胞,而不是人类癌细胞。如果是这样的话,实验还没有开展,就已经走向了错误的方向,因此不同实验室最后会得出千奇百怪的数据也就不奇怪了。

Vander Heiden的实验室和其他研究小组正在开发一种更接近模仿肿瘤间质液成分的培养基,因此他们可以探索在这种环境中生长的肿瘤细胞是否可用于更准确地预测癌症药物会影响身体细胞。

将胰腺肿瘤细胞的生长与肺癌细胞进行对比,研究人员发现组织液的成分会因肿瘤在体内的位置而异;而在相同位置生长,但基因组成具有差异的癌细胞,它们的组织液也存在轻微差异;然而实验发现,“基因”并没有“肿瘤位置”具有那么大的影响。“组织间液中营养素的成分,主要是由肿瘤内癌细胞与非癌细胞之间的相互作用决定的。”Vander Heiden说道。

Tardito 配制的 Plasmax 算是跨出了重要的第一步,但是距离 Plasmxa 的商业化应用还很远。商业化生产对于科学研究也是不可缺少的一环,商业培养基比各自实验室配制的培养基更标准化和产业化,其实是利于提升癌症研究的可重复性的。即使有实验室会自行尝试对培养基进行配制或者在 DMEM 里添加其他营养剂,但是在投入商业应用之前都不能为其他科学家带来显著作用。由于商业化的培养基一直没有更新换代,研究者只能用 DMEM 作为不完美的替代品,可以说研究者目前依赖于 DMEM 也是一种无奈之选。此外,不同厂商之间供应的 DMEM 也可能会对癌细胞生长状况造成影响,更不用说市场上还充斥大量的伪造产品。

该研究由美国国立卫生研究院,Lustgarten基金会,麻省理工学院精确癌症医学中心,抗癌药物,霍华德休斯医学研究所和麻省理工学院路德维希中心资助。

科学家此前发现,癌细胞可以通过募集那些非癌细胞帮助重建肿瘤周围的环境来保证癌细胞的存活和传播,包括支持性基质细胞和免疫细胞。Vander Heiden的实验室和其他研究小组正致力于开发模拟肿瘤组织间液的培养基,力求探索在这种环境中生长的肿瘤细胞,是否可以用于更准确地预测癌症药物如何影响体内细胞。

Plasmax 仅仅只是一个开始,其还缺乏血液里重要的一些组分,包括脂肪酸和蛋白质等。把癌细胞拿出来放置在培养皿里是无法完全模拟人体环境的,但这也是目前癌细胞研究最简便、安全的方法,任何癌症研究都离不开这种基础实验。因此如何将这项实验带上正确的轨道是科学家需要不断精进的事,Tardito 说,想制造出一种完美液体很难,我们能做的只能是不断缩小培养基与人体环境的差别。