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近年来,通过基于微流体的流式细胞术的开发,已经大大改善了单细胞可以被分析和操作的精确度和准确度。

光学显微镜和镊子可以在微观尺度上成像和操纵物体,用于细胞和分子生物学中的应用。然而,光学分辨率受到衍射极限的阻碍,因此显微镜和镊子都不能直接成像和操纵纳米物体。等离子体/光子纳米镜和纳米镊子中的新兴技术旨在实现纳米级分辨率,尽管高折射率材料结构很容易对纳米级生物样本造成机械和光热损害。、

引述外媒报道,中国科学院发布消息,中国研究团队开发了一种先进的成像技术,以前所未有的速度实现了超分辨率显微镜,并且图像数量更少。新方法应该可以捕获活细胞中以前无法达到的速度。

尽管其灵敏度,但微流体流式细胞术受到低通量和差的空间分辨率的限制。最近的研究试图彻底改变微流体流式细胞术成像技术以解决这些局限性。这导致了新平台的开发,将传统流式细胞仪提供的高通量与光学显微镜的空间分辨率相结合。

在最近发表在《光学:科学与应用》期刊上的一篇研究论文中,中国纳米光子学研究所Yuchao Li及其同事开发了一种光学显微镜系统,该系统使用活细胞作为微小透镜来成像和操纵小于光波长的物体。

ued赫塔菲官方 ,超分辨率技术通过克服光的衍射极限来实现纳米级分辨率。尽管纳米显微镜可以捕获细胞内单个分子的图像,但很难与活细胞一起使用,因为重建图像需要成百上千的图像-这个过程太慢,无法捕获快速变化的动力学。

现在,化学和生物工程研究所的科学家们的综述总结了最近对超高通量单细胞分析和多参数成像工具开发的研究。作者总结了几种微流体细胞聚焦方法,并详细介绍了最先进的检测方法;即基于摄像机和光电探测器的成像技术。该评论由Stavrakis及其同事在生物技术的当前观点杂志的分析生物技术特刊上发表。

通过将细胞捕获在纤维尖端上,他们展示了亚衍射极限成像和非侵入性设备对纳米物体的操纵。捕获的细胞形成生物放大器,可以在白光显微镜下放大分辨率为100nm的纳米结构。

在由光学学会出版的《高影响力研究》杂志Optica页中,中科院上海光学精密机械研究所的研究人员描述了他们如何使用称为“鬼影”的非常规成像方法提高纳米显微镜的成像速度。他们的新技术使用比传统纳米技术少几个数量级的图像来产生纳米分辨率。

可以击败模糊的相机

利用生物放大器,中国科学家们精确地操纵了具有50nm半径的单个纳米颗粒。

研究小组共同负责人王忠阳说:“我们的成像方法可以潜在地探测亚细胞结构中毫秒级尺度上发生的动力学,其空间分辨率为数十纳米-发生生物过程的时空分辨率。”

单个细胞或生物分子的同时处理取决于将细胞聚焦成单细胞流的能力。这允许细胞被分离并单独成像。用于操纵鞘流的几种技术,通过其注入样品的流体壁,改善了内部样品流的定位。该样品流容纳被研究的细胞并允许它们被最佳地放置用于成像。

该技术为光学成像提供了高精度工具生物纳米材料的传感和组装,没有机械或光热损伤。

结合技术以实现更快的成像

鞘液内细胞的高速运动是有问题的,因为它产生光学模糊,即围绕物体图像的模糊。消除光学模糊的尝试先前已经实现了成像流技术。这些技术试图耦合显微镜,其提供具有流式细胞术的良好图像分辨率,其具有差的空间分辨率。

操作小物体的光学成像对于医学诊断,生物传感,细胞探索,分子训练和材料组装至关重要。

新方法基于随机光学重建显微镜,这是2014年获得诺贝尔化学奖的三位研究人员之一。STORM,有时也称为光激活定位显微镜,是一种使用荧光的广域技术在发光状态和暗状态之间切换的标签。

然而,流动成像受到低中等吞吐量和大鞘液体积要求的影响。目前的研究主要集中在将流式细胞术方法与微流体耦合,提供高通量和低体积的优点。

镊子和显微镜是用于非接触成像和操纵微小样品的标准装置,微小样品的范围从几纳米到几微米。然而,使用该技术在纳米级成像是具有挑战性的,因为光学分辨率被限制在大约一半的照射波长。

采集成百上千个图像,每个图像捕获在给定时间开启的荧光标记的子集,可以确定每个分子的位置并用于重建荧光图像。

Schonbrun等。例如,结合使用具有衍射透镜的微制造平台来产生放大率和亚微米分辨率。微流体流动成像的最新发展成功地实现了更高的吞吐量,称为超高通量。

在过去的几十年里,科学家们已经取得了近场纳米镜和纳米镊子的巨大进步,以实现纳米分辨率的光学成像。这些成像技术被高折射率无机材料(例如贵金属和用于制造它们的半导体)所障碍,这些材料可在近场成像和操纵过程中机械地损坏生物细胞或组织的样品。

研究人员转向重影成像,以加快STORM成像过程。鬼影成像通过将与对象交互的光图样与不与之交互的参考图样相关联来形成图片。

Rane等人。展示了一种在高速下实现无模糊图像的方法,分析吞吐量为85 000个细胞/秒。此外,他们还能够进行多参数测量(多色荧光,明场和暗场图像),从而可以更精确地表征细胞。

因此,科学家研究了基于电介质微球的更简单的光学成像方案,以克服传统显微镜常见的衍射极限。虽然该技术可行,但这种微球基于人造无机材料,例如二氧化硅,二氧化钛和钛酸钡。因此,研究人员非常希望开发一种天然生物材料,以构建生物相容性装置,用于纳米级空间分辨率的生物成像,操作和生物放大。

单独地,灯光图案不会携带有关物体的任何有意义的信息。研究人员还使用了压缩成像技术,这是一种计算方法,可以使用更少的曝光量重建图像,因为它使用一种算法来填充丢失的信息。

光电探测器 - 图像采集的优越手段?

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“尽管STORM需要低密度的荧光标记和许多图像帧,但是我们的方法可以使用很少的帧和高密度的荧光团来创建高分辨率图像,”研究团队的其他共同负责人之一韩申生说。“它也不需要任何复杂的照明,这有助于减少可能损害动态生物过程和活细胞的光致漂白和光毒性。”

基于相机的方法受到灵敏度和成像速度之间的折衷的限制。但是,基于Photodetector的平台提供了捕获快速事件的替代路径。最近的方法集中在时间拉伸成像上,这显着提高了图像灵敏度。时间拉伸方法使用毫微微到皮秒的宽带光脉冲来筛选样品中的每个生物分子或细胞。

使用配备有CCD相机和×100物镜的常规反射模式显微镜观察样品并记录图像

提高成像效率

最初在加利福尼亚开发的时间拉伸成像技术最近在Tsia等人的香港进行了改进,其努力产生了第二代技术,称为非对称检测时间拉伸光学显微镜(或ATOM)。时间拉伸涉及将图像帧光学编码成超快激光脉冲。

中国纳米光子学研究所的科学家选择生物细胞取代微球,因为细胞既丰富又与生物系统接触时具有生物相容性。例如,科学家可以使用活细胞来操纵生物环境中的光,并作为光流控微透镜,光学探针,甚至将大肠杆菌作为生物光子波导。

为了实施这项新技术,研究人员使用了一种称为随机相位调制器的光学组件,将样品中的荧光转变为随机的斑点图案。通过这种方式对荧光进行编码,可以使非常快的CMOS相机的每个像素在单个帧中收集来自整个对象的光强度。

帧速率由超快脉冲激光的重复率决定,因此ATOM能够实现每秒数百万帧的成像速度。此外,可以放大编码图像。高速和灵敏度的综合效果消除了基于相机的方法所显示的折衷。

在目前的工作中,中国科学家们通过使用半浸入介质中的球形以实现在亚波长处聚焦来增强活细胞的折射率对比度。

为了通过重影成像和压缩成像形成图像,将光强度与参考光图案关联起来只需一步即可。结果是更有效的图像获取,并减少了形成高分辨率图像所需的帧数。

香港的研究人员拍摄了无需标记的细胞图像,这是一种用于获取高对比度图像的典型预筛选技术。105个单元/秒的帧速率远远超过传统传统传感器的帧速率,传统传感器提供百分之一。

纳米尺寸的光斑施加强的光学梯度力以捕获和操纵单个纳米颗粒,使得生物放大器还能够用作光学纳米镊子。

研究人员通过使用该技术对60纳米环成像来测试了该技术。新的纳米显微镜方法仅使用10张图像即可解决环问题,而传统的STORM方法可能需要多达4000帧才能达到相同的结果。新方法还解决了带有100幅图像的40纳米标尺。

细胞的荧光成像是更难以获得的细胞的一种参数测量。它需要在可见光谱之外的电磁辐射脉冲,因此ATOM的时间拉伸是不合适的。

科学家们在反射模式光学显微镜下进行了所有实验,并与电荷耦合器件相机和物镜相连。他们分别使用390 nm,560 nm和808 nm的光源进行激发,照明和俘获。使用具有锥形尖端的光纤。中国科学家将生物放大器困在光纤的末端,通过使用显微操纵器移动光头来控制它。选择光滑和球形细胞以最大限度地减少图像像差,并注意到细胞在半浸入溶液中时表现出更好的聚焦性能以维持细胞活力。

“我们希望这种方法可以用于各种荧光样品,包括那些荧光强度比本研究中所用荧光弱的样品。” Wang说。

通常,基于相机的方法可以缓慢读取微小的荧光脉冲,从而产生单个像素;这限制了荧光成像的速度。Diebold等人。最近已经解决了高速荧光成像的问题。受电信领域的启发,他们开发出一种生成更快图像读出率的方法。

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研究人员还希望使该技术更快,以实现具有大视野的视频速率成像,从而获取3D和彩色图像。

该技术称为使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像,使得来自每个像素的荧光在不同的射频上编码。这种方式类似于许多电视频道通过一根信号线传送到电视的方式,或者有多少台电脑连接到信号路由器。这允许相机一次检测最多200个像素的行。当应用于流式细胞仪时,FIRE使每个细胞能够以高分辨率,无模糊和多种颜色成像,从而允许收集更多的图像信息。

不同生物放大器的实验成像性能

在实验成像过程中,科学家们将一个半浸没式生物放大器放置在测试样品的顶部,并从样品中收集潜在的近场信息,以形成由光学显微镜检测到的虚像。使用多种细胞制备了各种生物放大器,包括细菌,酵母,红细胞和干细胞。对于第一个成像样品,他们使用光泳技术在玻璃基板上使用具有200nm直径的二维六方二氧化硅纳米球阵列。只有在其顶部具有生物放大器的纳米球可以在成像期间被分辨,而没有生物放大器的纳米球不能使用常规显微镜来解析。基于干细胞的生物放大器的放大系数M被确定为3.3倍,科学家们发现实验M取决于生物放大器的直径。随后,中国科学家们使用该直径的生物放大器进行所有实验。

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亚细胞结构和纳米图案字母的纳米光学成像

为了研究生物放大器的应用,科学家们成像了人上皮细胞,通过经由照明光和反射光的干涉增强的光-物质相互作用,成像目标为反射镜衬底上生长的上皮细胞。

虽然在传统的光学显微镜下难以区分纤维细胞骨架和双层结构,但在将生物放大器定位在上皮细胞上方之后科学家们能够分辨这两种结构。

为了改善成像视野,他们将生物放大器捕获在光纤尖端上并移动它以扫描样品。使用该设置来扫描代表济南大学首字母缩写词的纳米图案字母,这些字母是他们首先使用电子束光刻在硅上创建的。

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单个荧光纳米粒子的光学操作

此后,当它们通过物镜同时照射生物放大器上的近红外和UV激光束时,它们可以捕获并激发纳米颗粒。

对于这些实验,科学家们使用平均半径为50纳米的荧光纳米粒子。

当他们将单个纳米颗粒捕获在生物放大器的焦点中时,他们观察到感兴趣的样品的光学和荧光图像。然后使用标准光学镊子实时计算颗粒的俘获刚度。在没有接触且精确地通过光学器件的情况下操纵单个纳米颗粒的能力将有助于组装良好调节的纳米结构。

采用三维仿真和COMSOL软件对生物放大器的成像机理和捕获刚度进行了数值研究。他们观察到了由光学纳米喷射效应和镜面相干干涉增强组合产生的亚衍射极限光聚焦能力。

与具有均匀折射率的电介质微球相比,该方法的局限性包括由于天然生物放大器的不均匀细胞内结构导致的成像畸变。幸运的是,细胞内材料对可见光和近红外光是光学透明的,并且单个细胞内的光学相互作用相对较弱。细胞内活动还可以改变细胞中的部分折射率分布,从而在诱捕和成像过程中引起光畸变,但大多数细胞内活动是超快的并且不影响成像方案。

通过这种方式,Yuchao Li及其同事开发了一种新的实验成像技术,并通过FEM模拟验证了实验能力。

在单个设备中集成光学纳米显微镜和纳米镊子,在本研究中首次同时成像和操纵纳米结构。他们将该技术的分辨率提升至100纳米,并提出了无标记成像程序。科学家们认为这种生物放大器在超分辨率成像,实时传感和生物纳米材料的精确纳米组装方面具有新的机会。