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来自哈佛医学院的 Sean P. J. Whelan 教授及其研究团队,揭示了最致命的人类 RNA 病毒是如何精确调节其病毒基因组各个部分进行复制的。该研究结果明确了抑制这种病毒复制的新靶点,并为未来开发新一类抗病毒药物提供了理论支持。该研究发表于PNAS杂志。

流感病毒是危害全球公共卫生健康的重要病原之一,能在人群中引起大规模流行和季节性流感,每次暴发都会引起人类死亡并造成巨大的经济损失。流感病毒是分节段的负链 RNA 病毒,属于正粘病毒科,目前包括 A,B,C 和 D 四种类型。由于流感病毒易发生基因重配和抗原突变,现有疫苗无法提供持久性保护,再加上流感病毒的耐药性问题出现得越来越频繁,开发新型的抗病毒药物已然迫在眉睫。流感病毒聚合酶对于病毒复制增殖和宿主适应都具有重要作用,并且在不同类型流感病毒中较为保守,是抗病毒药物研发的重要靶点。因此对于流感病毒聚合酶工作机制的探索一直是研究热点。

病毒是精通入侵者。它们通过注射其遗传物质来蚕食宿主细胞,通常在一个细胞中制造数千个自身拷贝,以确保它们的复制和存活。

病毒是十分“精明的”入侵者,它们通过向宿主细胞注射其自身的遗传物质来“蚕食”宿主,通常一个病毒可在一个宿主细胞中制造数千个自身拷贝,以确保它们的复制和存活。

流感病毒聚合酶由 PA、PB1 和 PB2 三个亚基组成,并以核糖核酸蛋白复合物形式来行使病毒基因组复制和转录双功能。病毒基因组复制过程可以分为两步:第一步通过结合保守的病毒 RNA启动子从末端起始从头合成互补 RNA;第二步通过结合保守的 cRNA 启动子,从内部起始从头合成病毒基因组 RNA 产物。病毒基因组转录过程则依赖宿主细胞的 RNA PolII 复合物,通过掠夺并利用宿主来源的加帽 RNA作为引物合成转录产物,从而启动后续病毒蛋白的表达。病毒聚合酶合成 RNA 过程又可以进一步分为起始、延伸和终止三个阶段。

一些RNA病毒将其遗传物质作为单个片段插入,而其他RNA病毒则将其切成碎片。后者恰当地命名为分段病毒。

一些 RNA 病毒将其遗传物质以整个片段的方式整体插入宿主细胞,而另外一些 RNA 病毒则先将其自身遗传物质切成碎片,再插入宿主细胞。后者被命名为分段病毒(segmented viruses)。这种分段 RNA 病毒包含了我们最熟悉的流感病毒,它们每年造成数以万计的患者死亡。因此研究如何有针对性的对付这些病毒意义重大。

过去五年里,前人通过晶体学技术成功解析了 A,B 和 C 型流感病毒聚合酶的结构,并对它们的复制和转录功能机制有了初步认识,但是关于 D 型流感病毒聚合酶的研究鲜有报道。同时流感病毒基因组的复制和转录过程是一个极为复杂的过程,除了聚合酶本身,还需要病毒 RNA、其他病毒蛋白以及宿主因子的共同参与,才能高效准确地完成这个过程。目前对于这个复杂过程的认知尚有许多空白,亟需研究人员去填补。

这种分段的RNA病毒 - 包括引起流感等人类疾病的几种病毒 - 对研究人员来说是一个长期的谜团:它们如何实现每个细分的精确复制和插入?他们如何确保各个片段都被相同的酶复制,同时确保每个片段可以产生不同量的RNA?这种精细的调节对于制备成功复制所必需的正确水平的病毒蛋白是至关重要的。

研究人员一直对这些分段 RNA 病毒是如何实现每个遗传片段进行精确复制和插入感到疑惑,同时,这些病毒是如何确保各个片段都被相同的酶催化复制并确保每个片段可以产生不同量的 RNA 也不得而知。

ued最新官方网址 ,为了系统比较不同类型流感病毒聚合酶结构和功能特征以及分析聚合酶在与不同 RNA 启动子结合时的构象和工作机制,中国科学院微生物研究所研究人员以 D 型流感病毒聚合酶为对象来展开研究。首先利用昆虫细胞表达系统,成功纯化得到高纯度聚合酶蛋白并在体外证明其具有生理活性;然后利用冷冻电镜三维重构技术解析了 D 型流感病毒聚合酶复合体的近原子分辨率三维结构。通过与 A,B 和 C 型流感病毒聚合酶的结构比较发现,它们都具有一个保守且构象稳定的核心区域,包括 PA/P3 亚基的 C 末端,PB1 亚基和 PB2 亚基的 N 末端,以及柔性较大的外围结构域,包括 PA/P3 亚基的内切酶结构域,PB2 亚基的帽子结合域和核定位结构域等,提示不同类型的流感病毒聚合酶利用相似的机制合成 RNA 产物。

现在,哈佛医学院Blavatnik研究所的科学家们进行的研究得出了一个令人惊讶的答案:负责这种生存保证机制的病毒机器由来自复制开始段的另一端的RNA激活。

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为了深入研究流感病毒聚合酶合成 RNA 的分子机制,研究人员利用冷冻电镜三维重构技术,解析了 D 型流感病毒聚合酶与不同 RNA 启动子结合的近原子分辨率三维结构。研究人员首次发现 vRNA 启动子存在两种不同的结合构象,分别定义为 mode A 和 mode B,但是 cRNA 启动子只采取 mode B 方式与聚合酶结合。通过大量的细胞复制子和体外酶活功能实验表明,病毒基因组复制第一步 cRNA 的合成主要通过 mode A 构象进行调控,而 mode B 构象主要在复制第二步聚合酶合成 vRNA 时发挥作用,并且这一过程需要其他病毒或宿主因子的参与。而病毒基因组转录过程同时受到两种构象的调控。此外,mode A 和 mode B 构象在转运至酶活中心后会共用同一个催化前构象,并且这一构象与 mode A 的结合位点部分重合。

该研究结果于5月9日在PNAS上发表,旨在确定抑制分段病毒复制的新潜在目标。该组包括几种新出现的高致命病毒,如拉沙热病毒,像拉克罗斯和裂谷热的布尼亚病毒,以及更为人知和更常见的流感病毒。

图丨分段病毒 RdRP 结合结构域

值得思考的是,处于 mode B 构象的 3’-RNA 位于聚合酶的表面而未进入酶活中心,通过生物膜干涉实验发现 3’-RNA 与聚合酶亲和能力非常强,那么如何将处于 mode B 构象的 3’-RNA 转运至酶活中心?研究人员通过动态光散射实验分析不同状态下 D 型聚合酶的聚体形式,结果显示在加入启动子后,聚合酶易于形成二聚体甚至寡聚体,并且 cRNA 启动子更容易诱导这一过程。此前研究也曾报道过 A 型流感聚合酶能够形成二聚体和四聚体。这些证据提示,不同聚合酶间的相互作用可能诱导其构象变化,从而促进处于 mode B 构象的 3’-RNA 转运至酶活中心,但其分子机制还需进一步验证和探索。

气候变化已经改变并加剧了一些严重和新兴病毒在新地理区域的传播,对全球健康构成了严峻挑战。我们的研究结果确定了一种关键机制,允许其中一些病原体复制和存活,Sean PJ Whelan说。 ,HMS微生物学教授,哈佛大学病毒学项目主任。

现在,哈佛医学院 Blavatnik 研究所的研究人员通过对此类病毒的详细研究,得出一个令人惊讶的答案:负责病毒 RNA 复制起始的机制竟然是由复制过程最末端的 RNA 来激活的,这与先前我们对 RNA 复制的认知截然相反!

此项工作首次系统性地研究了流感病毒聚合酶与不同 RNA 启动子的相互作用机制,阐明了 RNA 启动子结合构象在合成不同 RNA 时所发挥的作用,并提出了聚合酶合成 RNA 起始阶段的工作模型,推动了人们对流感病毒聚合酶调控不同 RNA 合成机制的理解,为抗病毒药物开发提供了新靶点。

例如,拉沙热感染很少致命,但一旦发生实际疾病,就会导致五分之一的人在多个器官中出血或出血。根据美国疾病控制和预防中心的数据,在流行期间,死亡率可达50%。

哈佛大学病毒学项目主任 Sean P. J. Whela n表示,“气候变化在全球范围内加剧了一些较高致死性病毒的传播,这对全球健康构成了严峻挑战。例如,人类一般很少感染 Lassa 病毒,但一旦感染这种病毒,就会导致五分之一的人出现多个器官大量出血。根据美国疾病控制和预防中心的数据,在该病毒流行期间,其死亡率可达 50%。为了了解这些以往较为陌生的病毒,他们对这些病毒进行了相应的研究,并且明确了一些高致死性病毒复制的关键机制”。

该研究成果已在线发表在《自然 - 微生物学》杂志上,题为 Structural insight into RNA synthesis by influenza D polymerase。微生物所施一研究组博士生彭齐、联合培养硕士生刘雨骞和助理研究员彭如超为论文并列第一作者;研究员施一和中科院院士高福为论文共同通讯作者。该研究得到中国医学科学院病原生物所研究员邓涛、中科院生物物理研究所研究员章新政、南方科技大学冷冻电镜中心教授王培毅、微生物所研究员齐建勋和严景华等的大力支持,并得到中科院战略先导 B 专项、国家科技重大专项、中科院国际合作重大项目、国家自然科学基金委优秀青年科学基金和中科院青年创新促进会等的支持。

在研究中,Whelan和研究的合着者,Whelan实验室的研究生Jesse Pyle使用了Machupo病毒,这是一种沙粒病毒,像Lassa病毒一样感染啮齿动物,后者反过来将病毒传播给人类,导致致命的出血热。

在研究中,Whelan 和 Jesse Pyle 对一种名为 Machupo 的沙漠病毒进行了研究,这种病毒像 Lassa 病毒一样可感染啮齿类动物,被感染的啮齿类动物再将该病毒传播给人类,导致人类出现致命的出血热。我们熟知的流感病毒的基因组存在 8 个片段,而 Machupo 病毒只有两个片段,即小片段和大片段。因此这种病毒为研究人员研究病毒复制机制提供了一种更为简单的实验模型。

与流感病毒不同,其基因组有8个片段,Machupo病毒只有两个片段 - 称为小片段和大片片段 - 提供了一种更简单的方法来理解不同片段如何以正确的量复制。

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以前关于这种机制的线索来自对流感和La Crosse病毒的研究,这些病毒显示负责复制关键区段的病毒蛋白 - RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP) - 与该区段的5末端相互作用,这是与蛋白质开始复制的位置完全相反的一端。然而,这种互动的重要性尚未完全理解。

图丨5’ 末端 RdRP 作用机制

实验表明,将来自Machupo病毒片段5末端的短13个核苷酸长的RNA与启动RNA复制的催化剂RdRP混合

实际上,刺激了这种酶复制病毒片段的能力。两段Machupo病毒含有四种微妙不同的5RNA,每种都与RdRP酶结合。值得注意的是,科学家观察到,这些RNA决定了酶实际使用的四种不同起始位点中的哪一种。

Whelan和Pyle表示,这些结果不仅揭示了基础病毒学中的一个重要问题,而且还确定了一个新目标,可以阐明如何开发针对这种必需的5RNA激活的新型抗病毒药物。

目前市场上的大多数抗病毒药物直接靶向参与复制遗传物质或处理病毒蛋白质的病毒酶。然而,没有人干扰当前研究中描述的特定机制。

我们的研究表明,5RNA及其在病毒酶上的结合位点都是抑制病毒复制的潜在新靶点,Whelan说。一个重要的下一个目标是寻找干扰这一过程的分子并为新药设计奠定基础。

先前的研究者主要对流感和 La Crosse 病毒进行研究,他们发现这些病毒负责复制关键区段的病毒蛋白是 RNA 依赖性 RNA 聚合酶,它与需要被复制基因模板的 5' 末端相互作用,而正常蛋白质的转录往往是从 3’ 端开始。然而,这种酶与核酸的互相作用的重要性尚未被完全阐明。

Whelan 的实验表明,将 Machupo 病毒 5' 末端的 13 个核苷酸长的 RNA 与启动 RNA 复制的 RdRP 混合,可激活病毒对该片段的复制工作。Machupo病毒含有四种略微不同的 5' 末端 RNA,每种都可与 RdRP 酶结合。值得注意的是,研究人员发现,这些 RNA 决定了 RdRP 酶结合的起始位点。

Whelan 和 Pyle 表示,这些结果不仅阐明了基础病毒学中的一个关键机制,还阐明了如何利用 5’ 末端 RNA 激活来开发新型抗病毒药物。

目前市场上的大多数抗病毒药物都是直接靶向参与基因复制的关键酶或病毒中某个致病病毒蛋白,但并没有人利用此次发现的 5’ 末端 RNA 激活机制来抵抗病毒。因此,在阐明病毒复制机制的同时,更为重要的是 Whelan 和 Pyle 的工作为开发新一代抗病毒药物指明了道路。

-End-

参考文献:Jesse D. Pylea, Sean P. J. Whelan. RNA ligands activate the Machupo virus polymerase and guide promoter usage

请随简历附上3篇往期作品

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